2023年12月16日

野生和栽培灵芝中灵芝酸和总黄酮的提取及含量测定.pdf

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延边大学学报(自然科学版) 39号 12月4日 2013 收稿日期:2013年09月08日 作者简介:李成范(1958—),男,副教授,研究方向为天然产物中化学成分的分离与分析。 文章编号:10044353 04026904 野生和栽培灵芝中灵芝酸和总黄酮的提取及其含量测定(延边大学分析测试中心,吉林延吉133002)。 实测野生灵芝和栽培灵芝中的灵芝酸含量分别为0.366%和0.871%,相对标准偏差(RSD)分别为1.07%。 平均回收率野生灵芝和栽培灵芝中总黄酮含量分别为0.507%、1.31%和1.10%,平均回收率为99.39%。 关键词:提取; 决心; 野生和栽培灵芝; 灵芝; 总黄酮类化合物。 中图分类号:O657.32 文献标识码:anodicidandtotalflavonoidsinthewildandlantedGanodermalucidumL ICengeegaeeeeeeeeeeeaaeeeeeeef 野生和种植灵芝中的黄酮类化合物通过reeeeea和ndddedeeeeeeee紫外光谱仪提取。 野生和人工种植的灵芝中灵芝酸分别为0.366%、0.871%、0.507%、0.551%、1.31%、1.10%,平均回收率为99.39%。 关键词 灵芝(Ganodermalucidum)是一种药用真菌,具有增强机体免疫力、抗肿瘤、保肝解毒、改善心血管系统、抗病毒等功能。 灵芝的化学成分主要包括多糖、三萜、核苷、黄酮、氨基酸等,其中三萜化合物灵芝酸(灵芝酸)和黄酮类化合物是灵芝的主要活性成分。 测定灵芝中灵芝酸和黄酮类化合物的方法主要是反相高效液相色谱法等,但采用紫外分光光度法同时测定野生和栽培灵芝中的灵芝酸和黄酮类化合物尚未见报道。 本实验采用回流法提取野生和栽培灵芝,并采用紫外分光光度法测定灵芝酸和总黄酮的含量。 灵芝和总黄酮的研究开发奠定了材料和方法的基础。 1.1 样品采集和预处理。 野生和栽培灵芝采自安图县万宝镇。 将野生灵芝和栽培灵芝先用自来水清洗,然后用蒸馏水冲洗。 清洁并在 70°C 的烤箱中干燥。 将干燥的灵芝切成块,用粉碎机粉碎,过50目筛,即为灵芝。 延边大学学报(自然科学版) 1.2 主要仪器、设备和试剂 1. 2.1 主要试剂乙醇(体积分数为95%)。 仿品、冰醋酸、碳酸氢钠、盐酸、乙酸乙酯、高氯酸、亚硝​​酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、甲醇均为分析纯(天津分公司米欧化学试剂有限公司); 香草醛购自国药集团化学试剂有限公司; 齐墩果酸(质量分数98.0%)、芦丁(质量分数92.5%)购自中国医药生物制品有限公司。 1.2.2 研究所主要仪器设备:1012S型电加热恒温鼓风干燥箱(上海跃进医疗器械厂); RE52D旋转蒸发仪(上海青浦沪西仪器厂); U3400紫外分光光度计(日本日立); 电加热恒温水浴锅(上海医用核仪器厂); SHBA型循环水多用真空泵(上海宇康科教仪器设备有限公司) 1.3 方法 1.3.1 样品中灵芝酸的提取及含量测定 1.3. 1.1 标准曲线的绘制 将 2.2 mg 齐墩果酸置于 10 mL 容量瓶中,加甲醇定容至刻度,得到浓度为 0.22 mg·mL 的标准溶液。 准备准确移取 0.0 至 0.8 mL 上述对照溶液。 分别置于带塞试管中,蒸发溶剂,准确加入0.4mL5%(质量分数)香草醛冰醋酸溶液和1.6mL高氯酸,混匀后置于70℃恒温水浴中15min,冷却至室温,转移至10mL瓶中,加乙酸乙酯稀释至刻度,摇匀,在560nm处将2.0344g野生灵芝粉和2.0129g栽培灵芝粉加入100mL单颈烧瓶中。 1.3.1.2 样品液的制备,加入20mL 95%乙醇,回流3小时。 冷却并过滤后,向残留物中再加入20mL 95%乙醇。 合并滤液并将其置于旋转蒸发器中。 减压蒸出乙醇残渣,加100mL氯仿溶解,再用60mL 5%碳酸溶解。 分离碳酸氢钠溶液(冰浴)并用6mol盐酸调节碳酸氢钠溶液的pH值。 用 50 mL 氯仿分批萃取酸化溶液。 合并氯仿溶液,用无水硫酸钠干燥,减压蒸干,得粗灵芝酸。 ,用甲醇溶解后,用50mL容量瓶定容至刻度,备用。 1.3.1.3 灵芝酸含量的测定 取野生和栽培灵芝提取的灵芝酸溶液样品放入0.50-10mL容量瓶中,其余按1.。 3.1.1 1.3.2 黄酮类化合物的提取及含量测定 1.3.2.1 测定波长的选择:取样品溶液 1.0mL、0.3mL 5%亚硝酸钠、4.0mL 4%氢氧化钠溶解 0 .3mL 10%硝酸铝,在碱性条件下,类黄酮和硝酸铝发生复杂反应,形成红色复合物。 显色后,以试剂作为空白参比,在420-700nm范围内,在510nm处测定复合物。 有最大吸收,故采用1.3.2.2波长绘制芦丁2.9mg的标准曲线。 置于25mL容量瓶中,加入质量分数80%的乙醇定容至刻度,得到浓度为0.116mg·mL。 取芦丁对照液0.0 25 mL,用30%乙醇稀释至12.5 mL,备用。 加1.0 mL 5%亚硝酸钠试液,摇匀,静置6 分钟。 10%硝酸铝溶液 1 .0mL,摇匀,静置 6 分钟,加 4%氢氧化钠试液 10mL 30%乙醇稀释至刻度,摇匀,静置 12min,作为试剂使用空白,在 510nm 处加入样品溶液 1.3.2.3 制备[10] 将灵芝粉 3.0780g 和 3.0452g 加入 100 mL 单颈烧瓶中,各加 70 mL 95%乙醇,浸泡 0.5 h,回流反应2h,过滤,然后加入100mL9 5%乙醇,回流提取1.5h,抽滤,合并滤液,减压回收5~7mL乙醇,置100mL容量瓶中,稀释至刻度,摇匀。用60%乙醇提取,得到野生和栽培灵芝黄酮提取液1.3.2。 4.总黄酮含量的测定。 取野生灵芝和栽培灵芝黄酮提取液各0.50-3.00mL,置于250mL容量瓶中。 其余按1.3.2.2方法测定。 结果和分析。 2.1 灵芝含量的测定方法。 2.1.1 方法选择齐墩果酸(Oleanolic Acid)属于五环三萜类化合物,与灵芝酸结构相似。 因此,采用齐墩果酸作为灵芝酸测定的标准品进行分析。 1. 3.1.1 采用李成范方法测定的齐墩果酸标准溶液的体积:从野生和栽培灵芝中提取灵芝酸和总黄酮及其含量测定标准品,制备齐墩果酸标准曲线,结果表明:齐墩果酸标准溶液体积、含量及测定吸光度 标准溶液体积/mL 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 齐墩果酸含量/22.044.0 66.0 88.0 110.0 132.0 154.0 176.0 吸光度 0.0788 0. 1080 0.1302 0.1503 0.1751 0.2032 0.22 75 0.2610 数量和含量芦丁标准溶液体积 测得吸光度标准溶液体积/mL 0.5 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 芦丁含量/ 58116 232 348 464 580 696 吸光度 0 .1141 0.1436 0. 1872 0.2372 0.2928 0.3381 0.3964 齐墩果酸标准曲线 2.1.2 测定1.3.1.3 灵芝酸含量测定方法 灵芝类别 样品体积/mL 吸光度 灵芝酸含量 / 0.50.0953 0.374 1.00.1356 0.367 2.00.2182 0.358 3.00.2974 0.363 0.3 66 1.07 0.50.1487 0. 861 1.00 .2503 0.889 2.00。 4374 0.867 3.00.6311 0.868 0.871 0.81 2.1.3齐墩果酸等三萜类化合物在无水条件下的稳定性试验,与高氯酸相互作用会产生颜色变化,在560nm处有最大吸收。 取同一样品按上述方法处理,每1小时测定1.92%,表明7小时内显色反应基本稳定。 2.1.4 添加样品 为了验证提取方法的可靠性,回收试验采用了一组不同量的样品,添加等量的齐墩果酸标准品,在相同的测定方法条件下进行测定。 结果如表所示。 平均回收率为99.65%。 mL 齐墩果酸含量 1.074.72 22 96.23 97.77 1.074.72 22 97.12 101.82 1.0179.0 22 200.56 98.00 1.0179.0 22 201. 26 101.18 1.0179.0 22 2 00.89 99.50 2.2 黄酮类化合物的提取及含量测定 2.2.1 方法选择 用途以芦丁为对照品,加入铝离子试剂测定灵芝中总黄酮含量,同时控制合适的pH值,使黄酮类化合物与铝盐形成络合物,并出现稳定的特征吸收峰可以在可见光区域获得。 按1.3.2.2方法测得的芦丁标准溶液的体积,纵坐标即为芦丁的制备。 标准曲线,结果表明2.2.2总黄酮含量的测定1.3.2.4方法测定为供试品溶液中芦丁的浓度,2.2.3稳定性试验,同一样品按上述方法处理,求平均值每1 h测得的含量为0.51%~2.82%,表明显色反应发生在7 h。 灵芝样品量/mL 吸水总黄酮含量/